ISO 24914:2026 ใหม่ล่าสุด ว่าด้วยเรื่องข้อกำหนดทั่วไปและให้แนวทางสำหรับการพัฒนาและการประยุกต์ใช้วิธี Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ซึ่งแยกออกจาก ISO 22174 (ว่าด้วยเรื่องของวิธี PCR) อย่างชัดเจน
ทั้งๆ ที่เป็นวิธีทดสอบเชิงโมเลกุลเหมือนกัน แต่ทำไมข้อกำหนดใหม่สำหรับ LAMP นี้จึงแยกออกมาจากข้อกำหนดสำหรับ PCR? เนื่องจากวิธี LAMP มีใช้อย่างแพร่หลายและมีการใช้งานที่แตกต่างในช่วงสิ่งแวดล้อมที่กว้าง กล่าวคือบางสถานการณ์นำไปใช้งานภายนอกที่ไม่จำเป็นต้องมีการควบคุมหลายขั้นตอน หรืออาจนำเครื่องไปใช้งานในภาคสนาม ซึ่งถูกนำไปใช้อย่างหลากหลายทั้งในระดับภาคอุตสหกรรมและงานวิจัยอีกด้วย โดย LAMP มีจุดเด่นของวิธีดังนี้
จุดเด่นของ LAMP
- ตรวจวัดได้รวดเร็ว (Rapid): ตรวจพบผลได้ภายใน 1 ชั่วโมง หรือเร็วที่สุดเพียง 5 นาที
- มีความไวสูง (Sensitive) และความจำเพาะสูง (Specific) โดยวิธี LAMP จำเป็นต้องมีไพรเมอร์ตำแหน่งจดจำบริเวณพันธุกรรมจำเพาะของเชื้อจุลินทรีย์มากถึง 4-6 ตำแหน่ง
- มีความทนทาน (Robust): ทนต่อสารยับยั้ง (inhibitors) และมีขั้นตอนการสกัดกรดนิวคลีอิกที่ง่ายขึ้น เนื่องจาก การสังเคราะห์สายพันธุกรรมโดยใช้ Bst Polymerase โดยเป็น strand‑displacing DNA polymerase จึงทำให้ถูกยับยั้งจากสิ่งรบกวนได้ยาก และสิ่งนี้เองทำให้เกิดการสังเคราะห์ได้อย่างรวดเร็วและทนต่อสารยังยั้งดังกล่าวข้างต้น
- เหมาะสำหรับการใช้งานในภาคสนาม (Field-amenable): LAMP ต้องการเครื่องมือเพียงเล็กน้อย (Minimal instrumentation) เครื่องมือ LAMP บางชนิดสามารถใช้แบตเตอรี่และนำไปใช้ในพื้นที่ภาคสนามที่ไม่ใช่ห้องปฏิบัติการเฉพาะได้ โดยส่วนใหญ่ด้วยเทคนิค LAMP จะใช้เครื่องมือมีขนาดเล็กเนื่องจากใช้การสังเคราะห์สายพันธุกรรมที่อุณหภูมิคงที่ระหว่าง 60-65 องศาเซลเซียสเท่านั้น จึงไม่จำเป็นต้องมีเครื่องทำความร้อนขนาดใหญ่ ในการสังเคราะห์สายพันธุกรรมแบบเป็นรอบๆ เหมือนหลักการ PCR
ข้อกำหนดใหม่นี้มีขอบข่ายอย่างไร?
- เอกสารนี้ระบุข้อกำหนดทั่วไปและให้แนวทางสำหรับการพัฒนาและการประยุกต์ใช้วิธี loop-mediated isothermal amplification (LAMP) เพื่อใช้ตรวจหาจุลินทรีย์และตัวบ่งชี้ทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้อง (เช่น ยีนดื้อยาต้านจุลชีพ ยีนความรุนแรงของเชื้อ) ในห่วงโซ่อาหาร
- ข้อกำหนดนี้ใช้กับวิธี LAMP แพลตฟอร์ม และรายการทั้งหมดที่เกี่ยวข้องในห่วงโซ่อาหารและห้องปฏิบัติการ
- เอกสารนี้ไม่ครอบคลุมการใช้ LAMP เพื่อการหาปริมาณ
- การตรวจสอบวิธี (Validation) และทวนสอบ (Verification) ของวิธี LAMP ไม่ว่าจะเป็นวิธีทางเลือกหรือวิธีอ้างอิง ไม่ได้ครอบคลุมในเอกสารนี้ โดยรายละเอียดของการตรวจสอบและการทวนสอบของวิธีทางจุลชีววิทยาได้อธิบายไว้ใน ISO 16140 series และ ISO 17468
นอกจากนี้ ในข้อกำหนดฉบับนี้ยังมีการอ้างข้อกำหนดทั่วไปที่ใช้ร่วม หรือมีอธิบายไว้แล้วใน ISO 22174:2024 ดังนี้
Topic | ISO 22174: 2024 | ISO 24914: 2026 | Remark for ISO 24914 |
|---|---|---|---|
Terms and Definitions | 3.1-3.7 | 3 | |
Terms related to controls | 3.5 and 12.2.2.2-12.2.2.8 | 3.4-3.7 | |
Use of controls | 12.2.2.1 | 5.3.1-5.3.3 | |
General laboratory guidance and Laboratory setup | 9.2.1-9.2.4 | 5.2 | It covers almost all clauses of ISO 22174. |
Reagent and consumables | 10 | 6 | It covers almost all clauses of ISO 22174. |
Equipment | 11 | 7 | It covers almost all clauses of ISO 22174. |
Laboratory procedure | 5, 6 and 12.1 | 8.1-8.3 | It covers almost all clauses of ISO 22174. |
Data interpretation | Not included in this presentation 12.2.4 | 9.1-9.3 |
โดยข้อที่เป็นจุดเด่นของข้อกำหนด ISO 24914 นี้ คือการใช้และการแสดงผลตัวควบคุม (Use of controls)
Step | Positive process control (a) | Negative process control (a) | Positive extraction control (a) | Negative extraction control (b) | Internal/external amplification control (c) | Positive LAMP control (D) | Negative LAMP control (D) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
Sample treatment | ↓ | ↓ | |||||
Nucleic acid extraction | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | |||
Amplification | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ |
Detection | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↓ |
↓: กระบวนการที่ครอบคลุมโดยสารควบคุมนี้ (Procedures covered by this control)
A: กำหนดความถี่ในการใช้สารควบคุมนี้ โดยให้เป็นส่วนหนึ่งของโปรแกรมการประกันคุณภาพของห้องปฏิบัติการ
B: ต้องใช้สารควบคุมนี้ตลอดเวลา ยกเว้นกรณีที่มีการใช้สารควบคุมกระบวนการผลลบ (negative process control)
C: ต้องใช้สารควบคุมนี้เมื่อมีการตรวจสอบความถูกต้อง (Validation) การยืนยันความถูกต้อง (Verification) หรือการประเมินความเหมาะสมในการใช้งานของวิธีทดสอบสำหรับเมทริกซ์ (Matrix) ชนิดใหม่ โดยความถี่ในการใช้ระหว่างการทดสอบประจำวัน ให้กำหนดเป็นส่วนหนึ่งของโปรแกรมการประกันคุณภาพของห้องปฏิบัติการและพิจารณาเป็นรายกรณีไป
D: ต้องใช้สารควบคุมนี้ในการทดสอบ LAMP ทุกรอบการทดสอบ
จะเห็นว่า ตัวควบคุมที่บังคับทำทุกครั้งทุกรอบของการทดสอบ คือ
- Negative extraction control
- Positive and Negative LAMP control
ในส่วนตัวควบคุม Internal/external amplification control หรือ [E] IAC หรือ positive internal control
- โดยวิธี LAMP นี้ให้ใช้เฉพาะ เมื่อมีการตรวจสอบวิธี (Validate), ทวนสอบวิธี (Verify) หรืองานทดลอง (Evaluation) เท่านั้น ไม่จำเป็นต้องรันทุกครั้งกับตัวอย่างในงานทดสอบประจำวัน (Routine) เพื่อใช้ในการทดสอบตัวอย่าง (matrix) ใหม่ ต่างจาก ISO 22174 ที่จำเป็นต้องทำทุกครั้งในงานทดสอบประจำวัน
ในทางหนึ่งตัวควบคุมนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งในทวนสอบ หรือเฝ้าระวังสิ่งแวดล้อมของบริเวณการทดสอบ หากสิ่งควบคุมที่กล่าวมาข้างต้นโดยเฉพาะ Negative process control, Negative LAMP control ให้ผล Negative ก็สามารถมั่นใจได้ว่าในขั้นตอนการทดสอบและสิ่งแวดล้อมไม่มีการปนเปื้อนข้ามระหว่างการทดสอบ
ในข้อกำหนดฉบับนี้ยังมีข้อแนะนำสำหรับการแปลผลการทำซ้ำของตัวอย่าง (Replicate) ทั้งในเชิงชีวภาพหรือทางเทคนิค (biological or technical) ไว้อย่างชัดเจน ทำให้ผู้ทดสอบสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้
Replicate 1 | Replicate 2 | Interpretation of results / Further action |
|---|---|---|
+ | + | Target amplicon detected |
– | – | No target amplicon detected |
+ | – | Presumptive positive result reported |
– | + | Presumptive positive result reported |
ผู้ประกอบการและห้องปฏิบัติการ สามารถใช้มาตรฐานนี้ในการนำไปประยุกต์ให้ให้เหมาะสมกับสถานการณ์ต่างๆ มีความชัดเจนมากขึ้น ซึ่งแยกออกจาก ISO 22174 โดยเฉพาะเรื่องที่กล่าวมาขึ้นต้น
- ชัดเจนในเรื่องของหลักการ และเหตุผลของเอกสาร
- ชัดเจนในเรื่องตัวควบคุม (Controls) ที่ต่างจาก ISO 22174 อย่างชัดเจน
- ในเรื่องของการแปลผล การทำผลการทดสอบซ้ำที่สามารถทำได้และมีข้อแนะนำในการแปลผล
ผู้ประกอบการควรปรับตัวอย่างไร
ศึกษาข้อกำหนด ISO 24914 นี้อย่างละเอียด โดยเฉพาะการทดสอบควบคุม ที่อาจแตกต่างกัน เพราะไม่เหมือนกับการควบคุมโดยใช้หลักการ PCR (ISO 22174) ผู้ทดสอบควรต้องเตรียมข้อมูลในเรื่องการแสดงผลของตัวควบคุมแบบ Internal/ external amplification control ที่จำเป็นต้องมีทดสอบระหว่างการการตรวจสอบวิธี (Validate), ทวนสอบวิธี (Verify) หรืองานทดลอง (Evaluation) ในรายงานการทดสอบ อย่างไรก็ตาม หากไม่มีเอกสารหรือการทดสอบดังกล่าว สามารถติดต่อฝ่ายตัวแทนจำหน่ายหรือฝ่ายสนับสนุนด้านเทคนิคของวิธีนั้นๆ
หลักการพื้นฐานของ LAMP (อยู่ในส่วน Annex A, ISO 24914) และโซลูชั่นการตรวจหาเชื้อก่อโรคจาก Neogen® โดยใช้ Neogen® Molecular Detection SystemTM (MDS)
กลไกและการทำงานของ LAMP
- LAMP ใช้ Strand-displacing DNA polymerase ทำให้สามารถเพิ่มปริมาณ DNA ได้ภายใต้อุณหภูมิคงที่ประมาณ 60–65 °C โดยไม่ต้องทำ Thermal cycling แบบ PCR
- ใช้ ไพรเมอร์ 4 ตัว (F3, FIP, BIP และ B3) ซึ่งจดจำลำดับเป้าหมายทั้งหมด 6 บริเวณ บน DNA หรือ cDNA เพื่อให้มีความจำเพาะสูง
- Inner primers (FIP และ BIP) เริ่มกระบวนการสร้าง DNA และ Outer primers (F3 และ B3) ช่วยให้เกิดการแทนที่สาย DNA (Strand displacement) จนเกิด DNA ที่มีโครงสร้าง Stem-loop
- โครงสร้าง Stem-loop ที่เกิดขึ้นจะเป็น จุดเริ่มต้นของรอบการเพิ่มปริมาณ DNA และเกิดการสร้าง DNA ซ้ำต่อเนื่อง
- การเพิ่มปริมาณจะสร้างผลิตภัณฑ์ DNA ที่มีโครงสร้างกลับด้านจากแม่แบบเริ่มต้น และเกิด Inverted repeat structure ในบริเวณที่ถูกเพิ่มปริมาณ
- ผลิตภัณฑ์ DNA ที่ถูกเพิ่มปริมาณจะเกิด การยืดสายซ้ำหลายรอบ (Repeated elongation) ทำให้ได้ DNA ที่มีความยาวของ Stem แตกต่างกัน
- สามารถเพิ่ม Loop primers (Loop F และ Loop B) ได้ 1 หรือ 2 ตำแหน่ง เพื่อช่วยลดเวลาในการเพิ่มปริมาณเหลือประมาณ ครึ่งหนึ่งถึงหนึ่งในสาม ของวิธี LAMP ปกติ และช่วยเพิ่มความจำเพาะ
- LAMP สามารถใช้เพิ่มปริมาณ RNA เป้าหมาย ได้ โดยเติม Reverse transcriptase enzyme พร้อมกันในการทำปฏิกิริยาแบบขั้นตอนเดียว (One-step amplification) เนื่องจากเอนไซม์นี้มีความสามารถในการทำ Strand displacement ด้วย
หลายท่านอาจสงสัยว่าทำไม วิธีการสังเคราะห์ DNA ด้วยเทคนิค LAMP ถึงมีความทนทาน (Robust): ทนต่อสารยับยั้ง (inhibitors) เมื่อเทียบกับวิธีสังเคราะห์ DNA แบบ PCR ขออธิบายตามรายละเอียดดังภาพด้านล่างนี้ จะเห็นได้ว่าวิธี PCR ทั่วไปจะมีโอกาสที่สารยับยั้งจะสามารถเข้าไปขัดขวางการสังเคราะห์ DNA ได้ง่ายกว่าการสังเคราะห์ DNA โดยใช้วิธีการสังเคราะห์ DNA โดยเทคนิค LAMP
Neogen® Molecular Detection SystemTM (MDS) เป็นวิธีทดสอบที่ใช้หลักการ LAMP ในการขยายและตรวจจับ DNA ของเชื้อเป้าหมายด้วยความไว (sensitivity) และความจำเพาะ (specificity) ระดับโมเลกุล ให้ผลตรวจที่รวดเร็วกว่าวิธีมาตรฐานดั้งเดิม และมีความสะดวกต่อการใช้งาน ขั้นตอนง่าย และให้ผลที่ถูกต้องแม่นยำโดยได้รับการยอมรับในระดับสากลว่ามีความเทียบเท่ากับวิธีมาตรฐาน
ชุดทดสอบที่มีให้ท่านเลือกใช้ ได้แก่ สำหรับทดสอบ Salmonella, Salmonella SE/ST, Quantitative Salmonella, Listeria spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157 (Including H7), Campylobacter, Cronobacter, STEC (stx), STEC (stx and eae) gene screen และ Listeria Right Now ที่เป็นชุดทดสอบใหม่ล่าสุด ในการทดสอบหาเชื้อ Listeria spp. โดยใช้หลักการตรวจ RNA ทำให้สามารถข้ามขั้นตอนการ pre-enrichment ไปได้และได้ผลการทดสอบภายใน 2 ชั่วโมง
บทความที่น่าสนใจอื่นๆ
ยกระดับการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ทึบแสงด้วย LUMiReader X-Ray จากเยอรมัน
การศึกษาพื้นผิวแบบ 3 มิติ ด้วยกล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (Atomic Force Microscopy: AFM)
ทำความรู้จัก ISO 24914:2026 มาตรฐานสากลและการประยุกต์ใช้วิธี LAMP
เกณฑ์ Listeria Monocytogenes ของสหภาพยุโรปเปลี่ยนไป: ผู้ผลิตอาหารพร้อมรับมือหรือยัง?
รู้หรือไม่? เบื้องหลังอาหารทุกคำที่คุณทาน… อะไรคือ ‘ความลับ’ ที่ล็อคความปลอดภัยไว้ตั้งแต่สายการผลิต
จากการตรวจวัดสู่การตัดสินใจ: ผลการวิเคราะห์ช่วยสนับสนุนการประเมินความเสี่ยงสารก่อภูมิแพ้ในอาหารอย่างไร?
ปิเปตที่ใช้อยู่ยังตอบโจทย์หรือไม่? 4 สัญญาณที่บอกว่า ถึงเวลาเลือกปิเปตใหม่
ปิเปตของคุณยังแม่นอยู่หรือไม่? สำรวจ 4 สัญญาณสำคัญตั้งแต่ผลลัพธ์ที่ไม่สม่ำเสมอ การสึกหรอ ไปจนถึงปัญหาด้านสรีรศาสตร์และเทคโนโลยี อ่านเพิ่มเติม
ค่าความหนืดแม่นยำแค่ไหน? รู้จักการสอบเทียบเครื่อง Krebs Unit Viscometer
เครื่องวัดความหนืดรุ่นใหม่ล่าสุดจาก AMETEK Brookfield ความแม่นยำสูง มาพร้อมหน้าจอสัมผัส
เครื่องวัดความหนืด DV2PLUS รุ่นใหม่ล่าสุดจาก AMETEK Brookfield ที่มีความแม่นยำสูงและใช้งานได้สะดวกมากขึ้นด้วยหน้าจอสัมผัสรุ่นใหม่และการเชื่อมต่ออัจฉริยะ
การป้องกันสิ่งแปลกปลอม มุ่งเน้นสุขอนามัยและคุณภาพอาหาร
อุตสาหกรรมอาหารมีข้อกำหนดด้านสุขอนามัยและคุณภาพผลิตภัณฑ์สูงมาก เนื่องจากกฎระเบียบระหว่างประเทศที่เข้มงวด เช่น HACCP, ISO 22000
รู้จักนวัตกรรมใหม่ของเครื่องตรวจวิเคราะห์ด้วยมวล – Xevo TQ Absolute XR
Xevo TQ Absolute XR เป็นเครื่องมือวิเคราะห์มวลสารแมสสเปคโตรมิเตอร์ ที่ออกแบบมาเพื่อช่วยให้คุณมั่นใจทุกครั้งที่ต้องวัดสารในตัวอย่าง ไม่ว่าจะเป็นน้ำ อาหาร ยา หรือเลือด ก็ทำได้รวดเร็ว แม่นยำ และประหยัดมากขึ้น
คิดให้ไกลกว่าแค่ “ความหนืด” เปิดโลกรีโอโลยีที่เข้าใจง่ายและครอบคลุม
Discovery Core Rheometer (DCR) คือเครื่องรีโอมิเตอร์รุ่นใหม่ล่าสุดจาก TA Instruments ที่ออกแบบมาด้วยแนวคิดที่ว่า “Rheology ต้องง่าย และต้องลึกกว่าแค่ความหนืด” DCR แต่สามารถวิเคราะห์คุณสมบัติรีโอโลยีที่สำคัญได้ครบถ้วน